2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）Real time RT-PCR的试剂
（1）将Master Mix和酶置于冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA， swFluA， Swine H1 （swH1） 和RNaseP （RP）。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反应
反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。
1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；
2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N＝n＋1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N＝n＋2。
3）Master Mix：计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：
* 体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。
5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；
6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；
7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图（略）
注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。
8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。
9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。
10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。
11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；
12）将提取的核酸样本置于冰架上；
13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换枪头操作。
14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；
15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；
16）对剩下的样本，重复步骤13-15；
17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。
18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。
19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。
6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul，反应条件如下：
注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。
* 具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。
2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：
（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；
（2）没有足够的人类细胞以备检测；
（3）方法建立和实施不当；
（4）试剂和仪器原因。
3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：
（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。
（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA， swInfA， swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。
（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。
2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。
3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。
附件4：
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
二、引物
NIC引物
| 引物名称
| 碱基组成
| 目的片段大小
| 备注
|
FluA
| FluA-M-F30
| TTCTAACCGAGGTCGAAACG
| 235bp
| 甲型流感病毒M基因通用检测引物
|
FluA-M-R264
| ACAAAGCGTCTACGCTGCAG
|
H1HA
| H1 F1147
| AAGAGCACACATAATGCCAT
| 527bp
| H1N1亚型检测通用引物
|
H1 R1673
| CCATTRGARCACATCCAG
|
HuH1HA
| H1HA F768
| ACTACTGGACTCTGCTGGAAC
| 327bp
| 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
|
H1HA R1094
| CAATGAAACCGGCAATGGCTCC
|
SWH1HA-1
| SW-H1 F786
| AATAACATTAGAAGCAACTGG
| 153bp
| 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物
|
SW-H1 R920
| AGGCTGGTGTTTATRGCACC
|
RnaseP
| RnaseP F
| AGA TTT GGA CCT GCG AGC G
| 约80bp
| 与real-time PCR中RnaseP引物一致
|
RnaseP R
| GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT
|
