三、材料及仪器
1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、检测引物
7、Axygen 1.5mL离心管，货号：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，货号：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜：二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No. 9009032718．电泳槽、电泳仪
四、实验步骤
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。
3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000～14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30～50μL的Rnase-free Water，室温静置1～3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计：
检测标本RNA
质控参数：
阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）
阳性对照：已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）
1）按下表加入试剂：
PCR反应体系
组 分
| 体 积（μL）
|
RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer
| 11.9×n
5×n
|
10mM dNTP Mixture
| 1×n
|
Enzyme Mix
| 1×n
|
RNase Inhibitor
| 0.1×n
|
上游引物
| 0.5×n
|
下游引物
| 0.5×n
|
Total
| 20×n
|
对每一个建立的反应确定反应数（n＝拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N＝n＋1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N＝n＋2。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增，反应程序如下：
温度 （oC）
| 时间
| 循环数
|
60℃
| 1min
| 1
|
42℃
| 10min
|
50℃
| 30min
|
95℃
| 15min
|
94℃
| 30s
| 35
|
52℃
| 30s
|
72℃
| 1min
|
72℃
| 7min
| 1
|
4℃
| 保存
|
|
4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：称取2.0g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。
5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：
PCR引物
| 待检样品1
| 待检样品2
| 待检样品3
| 待检样品4
| 待检样品5
| 待检样品6
|
FluA
| _
| ＋
| ＋
| ＋
| ＋
| ＋/-
|
H1HA
| _
| _
| ＋
| ＋
| ＋
| ＋/-
|
HuH1HA
| _
| _
| ＋
| _
| _
| ＋/-
|
SWH1HA-1
| _
| _
| _
| ＋
| _
| ＋/-
|
RnaseP
| ＋
| ＋
| ＋
| ＋
| ＋
| _
|
结果判断
| 非甲型流感病毒
| 甲型流感病毒
非H1N1亚型
| 人季节性H1N1亚型流感病毒
| 猪H1N1亚型流感病毒
送国家流感中心复核
| 送国家流感中心检测
| 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题
|
